搁置了一段时间后，今天（周六）拖了Kaiyue Zhang去实验室将上次失败的试验继续搞起：使用新的引物对上次提取的DNA进行扩增。
直接说结果：比上次更失败，一点儿渣都没有扩出来。
跟Kaiyue Zhang和师姐Meiqin Wu讨论学习了下，总结如下。
{福尔马林保存过久的仔稚鱼样品DNA降解很厉害}
上次使用的样品是2011年的某973项目航次中的仔稚鱼样品，使用福尔马林浸泡保存了2年有余。由于甲醛产生的甲酸作用，DNA降解断裂可能比较严重（许多参考文献如是说），可能因为这个原因上次提出来的DNA跑电泳结果就很差，进而决定了PCR的结果不怎么可能会好。
新近从福建采集回来的样品我已改用PBS福尔马林溶液保存，缓冲液系统可能防止甲酸对DNA的损伤。希望下次试验能成功。
{PCR过程做阳性参照}
这是Meiqin Wu师姐教的（我还是不太了解，大概知道要做什么反正）：PCR的时候，同时做一个新鲜材料样品，以确保引物是有效的；使用不同浓度引物做平行，以确保合适的引物浓度；设计梯度温度进行PCR。
{即使有院士署名的论文依然可能坑爹}
由于今天试验很失败，Kaiyue Zhang对我的主要参考文献《福尔马林保存鱼类标本中大片段DNA的提取》进行了仔细的研读。Meiqin Wu表示长达7天的前处理，可能会有DNA降解的风险。Kaiyue Zhang表示50mg/ml的蛋白酶K浓度偏高（虽然对结果无甚影响，我想他可能就是觉得烧钱吧），同时溶解DNA的TE缓冲液体系浓度过高：500mmol/L Tris， 200mmol/L EDTA，10mmol/L NaCl，过量EDTA能螯合掉Mg离子以致阻碍PCR过程。看起来结果过于美好的PCR产物电泳图也令Kaiyue Zhang非常不满。根据该文所述引物，花了我同事Wei Kang几十块钱科研经费买来的“S2U”和”S2D”，在Kaiyue Zhang进行检查之后，也觉得特异性不好。