尝试1:从福尔马林固定的仔稚鱼样品中提取基因组DNA(续)

搁置了一段时间后,今天(周六)拖了Kaiyue Zhang去实验室将上次失败的试验继续搞起:使用新的引物对上次提取的DNA进行扩增。

直接说结果:比上次更失败,一点儿渣都没有扩出来。

跟Kaiyue Zhang和师姐Meiqin Wu讨论学习了下,总结如下。

{福尔马林保存过久的仔稚鱼样品DNA降解很厉害}

上次使用的样品是2011年的某973项目航次中的仔稚鱼样品,使用福尔马林浸泡保存了2年有余。由于甲醛产生的甲酸作用,DNA降解断裂可能比较严重(许多参考文献如是说),可能因为这个原因上次提出来的DNA跑电泳结果就很差,进而决定了PCR的结果不怎么可能会好。

新近从福建采集回来的样品我已改用PBS福尔马林溶液保存,缓冲液系统可能防止甲酸对DNA的损伤。希望下次试验能成功。

{PCR过程做阳性参照}

这是Meiqin Wu师姐教的(我还是不太了解,大概知道要做什么反正):PCR的时候,同时做一个新鲜材料样品,以确保引物是有效的;使用不同浓度引物做平行,以确保合适的引物浓度;设计梯度温度进行PCR。

{即使有院士署名的论文依然可能坑爹}

由于今天试验很失败,Kaiyue Zhang对我的主要参考文献《福尔马林保存鱼类标本中大片段DNA的提取》进行了仔细的研读。Meiqin Wu表示长达7天的前处理,可能会有DNA降解的风险。Kaiyue Zhang表示50mg/ml的蛋白酶K浓度偏高(虽然对结果无甚影响,我想他可能就是觉得烧钱吧),同时溶解DNA的TE缓冲液体系浓度过高:500mmol/L Tris, 200mmol/L EDTA,10mmol/L NaCl,过量EDTA能螯合掉Mg离子以致阻碍PCR过程。看起来结果过于美好的PCR产物电泳图也令Kaiyue Zhang非常不满。根据该文所述引物,花了我同事Wei Kang几十块钱科研经费买来的“S2U”和”S2D”,在Kaiyue Zhang进行检查之后,也觉得特异性不好。

Leave a Reply

Your email address will not be published.

This site uses Akismet to reduce spam. Learn how your comment data is processed.